Ngăn chặn màng sinh học Vibrio bằng chiết xuất củ gừng

Ảnh minh họa

Bổ sung chiết xuất củ gừng vào thức ăn, người nuôi tôm có thể ngăn chặn sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn Vibrio và bảo vệ tôm trước dịch bệnh chết sớm (AHPND).

Màng sinh học vi khuẩn và dịch bệnh

Màng sinh học của vi khuẩn được hình thành bởi các cộng đồng vi khuẩn bao bọc trong chất nền của các hợp chất polymer ngoại bào do chúng tự sản xuất ra. Vi khuẩn trong các màng sinh học biểu hiện hàng loạt đặc tính nổi bật - đây là sự khác biệt đáng kể so các tế bào vi khuẩn sống tự do. Sinh sống trong các màng sinh học còn giúp vi khuẩn sinh sôi nhanh và dễ hơn. Theo Viện Y tế quốc gia Mỹ, hơn 80% dịch bệnh do vi khuẩn gây ra ở người và động vật đều liên quan đến màng sinh học vi khuẩn. Vi khuẩn Vibrio gồm các phân lập gây ra dịch bệnh AHPND cũng hình thành màng sinh học trong lớp chitin biểu bì trong dạ dày tôm trước khi tế bào vi khuẩn sản sinh và giải phóng độc tố PirA và PirB phá hủy tế bào gan tụy liền kề và cuối cùng khiến tôm tử vong, gây ra bệnh chết sớm hàng loạt.

Để ngăn chặn hoặc xử lý AHPND, rất nhiều giải pháp đã được sử dụng, trong đó có kháng sinh. Nhưng, vấn đề nghiêm trọng nhất khi sử dụng kháng sinh là kháng thuốc - hiểm họa lớn nhất tới sức khỏe cộng đồng; hơn nữa, còn dẫn tới nguy cơ sản phẩm tôm bị cấm hoặc trả về tại một số thị trường nhập khẩu.

Để tránh các vấn đề liên quan đến kháng sinh, các nhà khoa học tại Đại học Mahidol, Đại học Burapha, Thái Lan đã nghiên cứu khả năng của chiết xuất thảo dược không làm chết hoặc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn mang mầm bệnh nhưng ức chế sự hình thành màng sinh học của chúng bên trong hoặc trên cơ thể vật chủ. Những loại thảo dược này đã được sàng lọc bước đầu tại phòng thí nghiệm (in vitro) để xác định khả năng ngăn chặn các chủng vi khuẩn V.parapaemolyticus 3HP (V.AHPND) hình thành màng sinh học trong môi trường Mueller Hinton (MHB) bằng 1 v/v glycerol và 1,5% NaCl nhưng không ức chế sự tăng trưởng của các tế bào vi khuẩn tự do. Từ quá trình sàng lọc nhiều chiết xuất thực vật, các nhà khoa học đã phát hiện chiết xuất củ gừng bằng phương pháp ethanol có tiềm năng chống lại V. AHPND.

Ức chế màng sinh học vi khuẩn AHPND

Để tạo ra chiết xuất củ gừng bằng phương pháp ethanol, đầu tiên là tách chiết bột củ gừng (20 g) với 95% ethanol (300 mL) bằng phương pháp chiết Soxhlet ở 780C trong 14 giờ. Dung môi (ethanol) sau đó được loại bỏ khỏi chiết xuất thu được bằng một bộ cô quay chân không ở 420C đến khi được nguyên liệu sệt màu nâu vàng (2,74 g). Chất này chiếm tỷ lệ 137 mg/g (13,7%) bột gừng.

Chiết xuất đậm đặc này sẽ được pha loãng trong dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO) (40 mg/mL); tiếp đến lại được pha loãng thêm với nước cất để tạo ra dung dịch ở hai nồng độ cuối cùng là 20 mg/mL và 2 mg/mL để sử dụng trong các thử nghiệm tăng trưởng của tế bào Vibrio, thí nghiệm hình thành màng sinh học và các thử nghiệm cho ăn.

Các dung dịch cuối cùng được đưa vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường MHB được bổ sung thêm 1,5 sodium chloride và đo lại mật độ quang tế bào pha loãng (O.D 600 nm). Dung dịch nuôi cấy vẫn được pha loãng đến khi O.D đạt 0,01 trong các khay vi thể để đạt nồng độ chiết xuất củ gừng cuối cùng là 0,2 mg hoặc 2 mg.

Nuôi cấy màng sinh học được thực hiện ở nhiệt độ 300C không khuấy trộn qua đêm trước khi màng sinh học được hình thành bị biến màu bằng tím kết tinh và độ dày của chúng được đo lại bằng máy đọc độ hấp thu O.D 600 nm. Chỉ số máy đọc càng cao, màng sinh học càng dày. Một thử nghiệm tương tự được thực hiện để đánh giá chiết xuất củ gừng có ức chế sự phát triển của tế bào tự do V.AHPND hay không. Vi khuẩn được nuôi cấy trong các khay không được bảo vệ trong môi trường MHB trung bình với 1,5% NaCl và để qua đêm ở nhiệt độ 30⁰C với tốc độ khuấy trộn 200 rpm.

Hấp thụ ánh sáng 600 nm được sử dụng làm dấu hiệu tăng trưởng của tế bào. Các chuyên gia quan sát thấy chiết xuất củ gừng ở cả hai nồng độ trên đều ức chế đáng kể sự hình thành màng sinh học V.AHPND nhưng không ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn vì vậy chiết xuất gừng củ ở nồng độ thấp hơn 400 Micro gam/mL, 300 Micro gam/m: và 100 Micro gam/mL cũng được thử nghiệm và toàn bộ nồng độ này đều ức chế sự hình thành màng sinh học vi khuẩn (Hình 1).

Tôm giảm tỷ lệ chết sau khi nhiễm V.AHPND

Trộn lẫn chiết xuất củ gừng với thức ăn công nghiệp cho tôm post (ở 2 tỷ lệ: 0,2 mg/g và 2 mg/g thức ăn) và cho ăn lặp lại 3 lần trên một nhóm TTCT trong 7 ngày trước khi tôm được thử thách với virus V.AHPND bằng phương pháp nhúng 105CFU/mL. Các nhà khoa học tiếp tục cho tôm ăn thức ăn tương ứng trong khi tôm đối chứng được cho ăn thức ăn thông thường không bổ sung phụ gia gừng trong thời gian 9 ngày nữa. Suốt thời gian này, tỷ lệ chết và sức khỏe của tôm được theo dõi và so sánh với nhau.

Từ các kết quả đạt được có thể thấy, thức ăn bổ sung phụ gia củ gừng ở tỷ lệ 2 mg/g hoặc 0,2 mg/g giúp TTCT chống lại sự lây nhiễm virus V.AHPND. Tỷ lệ sống trung bình của tôm được ăn bổ sung gừng theo 2 tỷ lệ trên lần lượt là 50% và 42,6%, cao hơn tôm đối chứng không ăn bổ sung gừng là 42,5% và 35%. Tỷ lệ sống của nhóm đối chứng không thử thách dịch bệnh là 92,5% (Hình 2).

Các thử nghiệm mô bệnh học của tôm được thử thách với vi khuẩn phân lập AHPND (3HP) bằng phương pháp nhuộm mô hematoxylinvà eosin (H&E)cho thấy, dịch bệnh AHPND ít có khả năng lây nhiễm ở những con tôm được cho ăn bổ sung chiết xuất gừng củ.

Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học cũng phát hiện chiết xuất củ gừng không có tác động tiêu cực rõ rệt nào tới tính thèm ăn của tôm hoặc lên tăng trưởng của tôm. Có 3 hợp chất mang hoạt tính sinh học tiềm năng trong chiết xuất củ gừng (6-gingerol, 8-gingerol và 6-shogaol) cũng được thử nghiệm để đánh giá hiệu lực  ngăn chặn hình thành màng sinh học in vitro và 6-shogaol được phát hiện có hiệu lực mạnh nhất. Không hợp chất nào nói trên ảnh hưởng tới tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường MHB.

Các kết quả nghiên cứu đã khẳng định, sử dụng các phụ gia thức ăn chứa gừng củ để ngăn chặn hình thành màng sinh học là một hướng tiếp cận mới và hiệu quả trong việc giảm thiểu tác động tiêu cực của AHPND trong nuôi tôm.