Phương pháp đếm tảo

Bài viết về phương pháp đếm tảo trong phòng thí nghiệm

A. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TẢO TRONG GIỌT MẪU

Là phương pháp đơn giản và dễ thực hiện nhất, tuy nhiên độ chính xác không cao.

Cách đếm: lắc đều mẫu, nhỏ 1 giọt mẫu đếm (khoảng 0,02 mL) lên lame và xem dưới kính hiển vi. Nếu tìm được 1 tế bào tảo trong giọt mẫu thì mật độ tế bào vào khoảng 50.000 TB/ lít nước.

Nhỏ giọt mẫu lên lame đếm tế bào tảo

B. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TẢO BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

Dùng cho mẫu có mật độ tế bào cao.

1. Cấu tạo buồng đếm

Là phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ.

Trên mỗi khoảng nhỏ của khoảng giữa có kẻ một lưới đếm gồm 400 ô vuông nhỏ có tổng diện tích 1 mm² bao gốm 25 ô vuông lớn. Mỗi ô lớn chia thành 16 ô vuông nhỏ, như vậy buồng đếm có 400 ô vuông nhỏ (16X25).

• Diện tích 1 ô vuông nhỏ 1/400 mm²

• Diện tích 1 ô vuông lớn 1/25 mm²

Buồng đếm có lá kính dày để đậy, rộng 22 mm. Độ sâu buồng đếm hồng cấu (tính từ kính đậy tới mặt buồng đếm) là 0,1 mm.

• Thể tích của buồng đếm = 1 mm² * 0,1 mm = 0,1 mm³

Buồng đếm hồng cầu

Giao diện chi tiết buồng đếm hồng cầu

Diện tích và thể tích của các ô vuôngtrong buồng đếm hồng cầu

2. Cách đếm

Chuẩn bị mẫu

• Lắc đều chai đững mẫu trong 30 giây.

• Dùng pipet hút 10 µL dịch mẫu đếm.

• Đậy buồng đếm bằng lamel chuyên dụng.

• Nhẹ nhàng dùng đầu pipet đặt vào giữa cạnh buồng đếm – nơi tiếp giáp với lamel, đẩy nhẹ pittong, dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.

Cách cho mẫu nước vào bồn đếm

• Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch mẫu đếm, các rãnh chung quanh không bị dính ướt.

• Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch mẫu đếm tràn đầy các khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1 mm.

• Đợi vài phút cho tế bào tảo chìm xuống buồng đếm.

• Đặt lên kính hiển vi, tìm buồng đếm bằng vật kính 10, đếm bằng vật kính 40.

Cách đếm:

Vị trí: tại ô trung tâm của buồng đếm. Đếm tại những vị trí màu đỏ tại ô trung tâm và theo đường zig zag. Đếm một hàng – ghi số liệu 1 lần. Đếm càng nhiều ô, độ chính xác càng cao.

Vị trí đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu

• Nếu lượng tế bào trong một ô ít thì nên đếm toàn bộ buồng đếm (gồm 4 ô vùng màu xanh và cả ô trung tâm) nhằm tăng độ chính xác của mẫu đếm.

Tế bào tảo trên lưới buồng đếm hồng cầu

Qui tắc đếm: trong một ô nhỏ, các tế bào dính vào đường phân cách (là vạch gồm 3 đường liền kề) bên phải ở dưới không đếm, các tế bào dính vào đường phân cách ở trên và bên trái thì đếm.

Đếm 2 lần, nếu kết quả quá chênh lệch thì đếm thêm lần thứ 3.

Qui tắc đếm

Tính kết quả:

Trong mẫu không cô đặc, mật độ tế bào thấp, đếm toàn bộ 1 mm² buồng đếm, tính như sau:

Ta có:

1 mm³ = 0,001 cm³ = 0.001 mL = 1µL

0,1 mm³ = 0,0001 cm³ = 0,0001 mL

Trong mẫu không cô đặc, mật độ tế bào dày, chỉ đếm các ô hình chéo (màu đỏ) của ô trung tâm thì tính như sau:

• Bước 1 – Tính trung bình: tính ra số tế bào trung bình trong 1 ô nhỏ (0,25x0,25 mm).

• Bước 2 – Tính thể tích: tính thể tích của 1 ô nhỏ = 0.25 mm x 0.25 mm x 0,1 mm (là độ cao từ mặt kính phủ tới buồng đếm) = 0.00625 mm³ = 0.00625 µL = 0.00000625 mL.

• Bước 3 – Tính số TB/mL: giả sử có 123.456 tế bào trong 0.00625 µL, thì = 123.456 TB/0.00000625 mL = 19.752.960.000 tế bào/mL.

• Bước 4 – Tính hệ số pha loãng: nếu mẫu có pha loãng, thì lấy lượng vừa tính được chia hệ số pha loãng.

Lưu ý khi sử dụng buồng đếm hồng cầu:

Loại buồng đếm: có nhiều loại với kích thước lưới đếm khác nhau. Trong một buồng đếm cũng có các lưới với kích cỡ khác nhau nên phải biết kích thước lưới và chiều cao buồng đếm(trong tài liệu hướng dẫn kèm theo) nếu không sẽ tính toán sai.

Sử dụng lamel kèm theo: loại này dày hơn so với lamel tiêu chuẩn 0.15mm, do đó ít linh hoạt nên không bị ảnh hưởng từ sức căng bề mặt của chất lỏng, đảm bảo chiều cao của chất lỏng được chính xác.

Các tế bào di chuyển: các tế bào di chuyển rất khó đếm nên phải cố định tế bào.

Vật kính của kính hiển vi: buồng đếm hồng cầu dày hơn nhiều so lam bình thường nên có thể làm vật kính của kính hiển vi va chạm với buồng đếm hồng cầu khi tập trung hình ảnh để quan sát.

Số ô vuông cần đếm: nồng độ càng thấp, thì số ô vuông phải đếm càng nhiều, nếu không sẽ bị lỗi thống kê.

3. Vệ sinh buồng đếm

Dùng hơi xịt sạch buồng đếm sau đó rửa bằng nước sạch. Lập lại thao tác rửa 2 lần. Cuối cùng phơi trên giấy thấm nước.

Xịt sạch dịch mẫu đếm

Rửa bằng nước sạch

Phơi trên giấy thấm nước

C. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TẢO BẰNG BUỒNG ĐẾM SEDGWICK

Dùng cho mật độ tế bào trong mẫu thấp, dưới 5 TB/mm² buồng đếm.

1. Cấu tạo buồng đếm Sedgwick

Kích thước của buồng đếm là 50 x 20 x 1 mm. Diện tích buồng đếm là 1.000 mm² và thể tích là 1mL. Kính phủ có kích thước 50 x 20 mm.

Đáy buồng đếm Sedgwick chia thành 50 cột, 20 dòng, tổng cộng 1.000 ô vuông.

Buồng đếm Sedgwick

2. Cách đếm

Chuẩn bị mẫu:

• Lau sạch buồng đếm và phủ kính chuyên dụng.

• Dùng pipet hút 1 mL dịch mẫu đếm.

• Nhẹ nhàng dùng đầu pipet đặt góc dưới của buồng đếm, bơm dịch mẫu vào buồng đếm từ góc này và chuyển dần lên góc trên sau cho dịch mẫu đầy buồng đếm. Lưu ý: không được có bóng khí trong mẫu đếm.

• Chờ 5 - 10 phút cho tế bào tảo lắng xuống.

• Để lên kính hiển vi, tìm buồng đếm bằng vật kính 4 - 10.

Chuẩn bị mẫu cho buồng đếm Sedgwick

Cách đếm:

Số ô vuông đếm tùy thuộc vào số tế bào tảo. Yêu cầu phải trên 200 tế bào/ 1 lần đếm.

• Nếu khoảng 5 TB/ ô vuông: chọn ngẫu nhiên ba vùng để đếm ở trên, giữa, dưới của buồng đếm và tất cả các ô vuông từ trái qua phải.

• Nếu khoảng 20 TB/ô vuông: chọn ngẫu nhiên ba vùng để đếm bên trái, giữa, phải của buồng đếm và tất cả các ô vuông từ trên xuống dưới.

• Nếu khoảng 50 TB/ô vuông: chọn ngẫu nhiên một số ô vuông ở các vùng khác nhau của buồng đếm và đếm.

3. Tính toán:

Số tế bào/mL = Lượng tế bào trung bình đếm được trong 1 ô x 1.000

4. Vệ sinh buồng đếm

Dùng hơi xịt sạch buồng đếm sau đó rửa bằng nước sạch. Lập lại thao tác rửa 2 lần. Cuối cùng phơi trên giấy thấm nước.

D. KẾT LUẬN

Ứng dụng của xác định mật độ và thành phần loài tảo trong nước nuôi là nhằm cung cấp thêm một căn cứ cho việc đưa ra dự đoán tình trạng hiện tại và diễn biến tiếp theo của nước ao nuôi cũng như sức khỏe tôm.